抗体-寡核苷酸偶联物(Antibody-Oligo Conjugate,AOC)整合了单克隆抗体的精准靶向能力和寡核苷酸的基因调控功能，有望突破传统寡核苷酸药物递送效率低与抗体药物仅作用于胞外靶点的双重局限，被视为下一代靶向基因治疗的重要方向。然而，抗体与寡核苷酸两类生物大分子的共价偶联，在产物均一性控制、OAR变异体分离等方面带来了远高于传统ADC的工艺复杂度，而偶联产物的均一性与纯化收率时常是AOC项目从临床前向临床阶段推进的瓶颈。
博腾蛋白与偶联药物CDMO服务平台在AOC领域已建立了多种偶联技术能力，平台兼具位点特异性偶联和随机偶联两种技术路线，并具备自主寡核苷酸载荷合成能力，为行业提供了从早期研发到GMP生产的灵活解决方案。本文分享的两个案例，分别采用了工程化半胱氨酸定点偶联与链间二硫键还原随机偶联两种策略，实现了OAR值达0.997(接近理论理想值1)、目标产物回收率超50%的工艺成果，为AOC分子的工艺开发提供了可参考的解决方案。
AOC生产的核心工艺挑战
与传统ADC药物或裸抗体药物不同，AOC涉及抗体与寡核苷酸两类生物大分子的共价连接，其生产工艺复杂度显著提升。当前行业在AOC放大生产推进中普遍面临以下共性难题：
偶联均一性与OAR控制：无论是随机偶联还是位点特异性偶联，如何在分子层面精确控制每个抗体上连接的寡核苷酸数量(OAR值)，并尽量减少OAR变异体的产生，是决定产物批间一致性和药理活性的核心前提。非特异性偶联导致的OAR分布弥散，不仅增加纯化难度，也可能引入活性不明的分子变异体。
产物聚集与稳定性：寡核苷酸载荷的引入可能改变抗体表面的电荷分布与疏水性，增大偶联物的聚集倾向。聚集体的存在不仅影响药物安全性和体内药代行为，还会显著降低纯化收率，增加生产成本。
纯化分离效率：OAR变异体与目标产物在电荷性质与分子尺寸上往往较为接近，尤其在随机偶联路线中，变异体组分的分离尤为困难。如何在保证分离度的前提下实现目标产物的高回收率，是下游工艺开发的核心技术瓶颈之一。
分析表征体系的复杂性：AOC的完整表征需要同时监测抗体部分、寡核苷酸部分以及偶联物的整体结构，对分析方法的正交性和灵敏度提出了更高要求。
针对上述挑战，工艺开发团队需要对偶联化学、纯化分离与分析表征技术进行系统研究与精细的工艺控制。以下通过两个代表性案例，呈现博腾应对不同偶联工艺挑战的策略选择与解决路径。
案例一：基于工程化半胱氨酸(ENG Cys)的位点特异性偶联
该工艺遵循“还原去保护—氧化复性—定点偶联—层析纯化”的技术主线(图1)：首先对抗体进行还原处理，完全脱除工程化半胱氨酸上的保护基团；随后在受控氧化条件下重建链间二硫键，恢复抗体的天然构象。去保护后暴露的游离巯基与连接子-寡核苷酸偶联物发生定点偶联，粗产物经阴离子交换层析(AEX)纯化，最终获得高纯度的OAR1目标产物。
图1基于ENG Cys的位点偶联工艺流程
该路线的难点集中于两个关键环节：
脱保护环节：需在完全去除保护基团的同时，控制抗体聚集并维持其结构完整性，两者之间存在张力。
纯化环节：需从复杂粗产物中高效分离OAR1(寡核苷酸抗体偶联比值为1)目标产物，尽量减少OAR变异体的干扰，对层析分辨率的要求极高。
解决方案与结果
针对上述两大难点，博腾团队逐一开展系统优化，以精细的工艺控制确保位点特异性偶联工艺的稳健与可重复。
① 多维度调控反应条件，兼顾脱保护效果与抗体稳定性
系统筛选pH、温度与反应时间，并考察多种共溶剂对抗体稳定性的保护作用，锁定最优条件组合；同时在偶联反应前引入可选的柱精纯步骤，在关键节点去除潜在聚集体，将风险控制显著前移。
结果：整个工艺各中间体SEC纯度均稳定保持在97.5%以上(图2)，抗体质量全程可控。
② 系统优化阴离子交换层析(Anion Exchange Chromatography,AEX)条件，实现OAR1与变异体的高效分离
对 AEX层析的梯度、流速及上样量进行系统筛选，在保证分辨率的前提下最大化目标产物回收率。
结果：优化后的层析条件高效分离OAR1产物与OAR变异体，OAR值达0.997，逼近理论理想值1(图3)。
图2脱保护蛋白检测结果(完整分子量)
图3阴离子交换纯化层析谱图和质量分析数据
案例二：基于链间二硫键还原的随机偶联
该工艺遵循"部分还原—偶联反应—层析纯化"的技术主线(图4)：在严格控制的还原条件下对抗体进行部分还原，打断部分链间二硫键、释放适量游离巯基；游离巯基随后与连接子-寡核苷酸偶联物发生偶联反应。粗产物经AEX纯化，去除未偶联抗体、高OAR副产物及游离寡核苷酸，最终获得OAR1目标产物。
图4基于链间二硫键还原的随机偶联工艺流程
随机偶联的核心难点在于反应选择性与产物均一性的控制，具体体现在两个环节：
偶联环节：还原反应同时作用于多个链间二硫键，不同抗体分子被还原的位点与数量存在差异，粗产物中不可避免地混有不同OAR值的组分。精确控制还原程度与偶联化学计量比、最大化OAR1收率，是本工艺的关键。
纯化环节：OAR变异体与目标产物的电荷性质较为接近，对下游层析分离的分辨率提出更高要求。
解决方案与结果
针对上述难点，博腾团队围绕偶联化学、纯化分离与分析表征三条主线逐一开展系统优化。
① 系统筛选还原条件与化学计量比，提高粗产物中OAR1比例
评估还原剂种类、用量及反应时间对二硫键还原程度的影响，确定可稳定产生目标数目游离巯基的还原条件；在此基础上进一步调整寡核苷酸投料当量，优化偶联反应化学计量比。
结果：粗产物中OAR1比例达到55%以上(图5)。
② 优化AEX洗脱流程，提高目标产物回收率
针对OAR变异体与目标产物电荷性质接近的特点，对AEX的梯度洗脱流程及上样量进行系统筛选与调整。
结果：OAR1目标产物回收率达到50%以上(图6)。
③ 建立AEX与LC-QTOF质谱联用的正交分析方法
用于工艺开发中准确监测OAR分布并确认产物结构，为条件优化提供数据支撑(图7、图8)。
图5OAR1比例
图6阴离子交换纯化层析谱图
图7阴离子交换层析纯度分析
图8QTOF质谱分析
小结
位点特异性与随机偶联两条工艺路线，分别适用于不同的分子特性与项目需求下的工艺开发场景。上述案例表明了无论采用何种策略，对反应过程的精确控制、纯化工（850102）艺的系统优化，以及分析方法的正交构建，始终是工艺开发的核心。
基于这些工艺开发经验，博腾蛋白与偶联药物CDMO服务平台已支持了多个涵盖siRNA、PMO和ASO载荷的项目，技术能力覆盖赖氨酸偶联、基于半胱氨酸的随机偶联、酶催化位点特异性偶联以及工程化半胱氨酸介导的位点特异性偶联等多种方式，充分验证了不同AOC形式之间技术转移的可行性。
