近日，成都先导的药物研发团队在共价DNA编码化合物库（CoDEL）技术领域取得重要进展，相关研究成果《Deep seeking covalent DNA encoded library for novel JAK3 inhibitor discovery》发表于国际知名学术期刊《Bioorganic & Medicinal Chemistry》。

　　图1：Bioorg Med Chem. 2025, 132, 118448. DOI: 10.1016/j.bmc.2025.118448.

　　该研究聚焦于JAK3这一重要的免疫疾病靶点，通过精心设计并筛选包含不同数量共价弹头的CoDEL包，成功发现了6个全新结构系列的高活性、高选择性JAK3共价抑制剂。其中，最优异的化合物在活性（IC50）达到了pM级别，并在小规模激酶谱测试中展现了优异的选择性。

　　图2：图文摘要。

　　DEL技术遇上共价抑制：

　　强强联合的创新范式

　　与传统药物可逆地与靶点结合不同，共价抑制剂能像“魔术贴”一样与靶蛋白形成稳固的共价键。这种机制使其具备效力强、作用持久、选择性潜力高等优势，尤其适用于应对因基因突变而产生的耐药性问题，在肿瘤、自身免疫性疾病等领域展现出巨大潜力。

　　成都先导的CoDEL技术能够以极高效率探索超十亿规模的化合物海洋，极大地加速了苗头化合物的发现进程。将共价弹头预先整合进DEL库中，意味着可以直接筛选出能通过共价键与靶点结合的分子，这是一种更为直接、高效的发现路径。

　　图3：从CoDEL中发现的代表性共价抑制剂。

　　我们的研究：

　　解答共价DEL设计的关键问题

　　在本项工作中，我们深入探索了两个核心问题：（1）在DEL中预先安装共价弹头，对于发现全新苗头化合物究竟有多大影响？（2）一个高效的CoDEL，到底需要多少个“弹头”就足够了？

　　匠心构建：

　　如何为CoDEL精选“精准弹头”？

　　成功的筛选始于高质量的化合物库。我们拥有一个包含262个靶向不同氨基酸残基（如Cys、Lys、Tyr等）的共价弹头分子库。然而，并非所有弹头都适合用于DEL构建。因此，我们建立了一套多层次、多维度的严格筛选流程，以确保入选的每一个弹头都具备适宜的反应活性、出色的稳定性以及良好的成药潜力。

　　第一关：反应可行性。我们首先验证弹头能否高效地与DNA进行连接。我们优先选择与DNA兼容性好的温和化学反应，如酰基化/反向酰基化，同时也应用了还原胺化、脲形成等多种化学方法，为库的多样性构建奠定了坚实基础。

　　第二关：反应活性“恰到好处”。我们利用谷胱甘肽（GSH）测定法对弹头的反应活性进行精准调控。过于“暴躁”（半衰期<1小时）的弹头容易导致非特异性结合，产生筛选噪音，因此被排除在外。最终入选的，是那些反应温和且可控（半衰期>1小时）的弹头。值得一提的是，近80%的评估弹头表现出了超过60小时的超长半衰期，这为库的稳定性提供了保障。

　　第三关：全面稳定性考核。我们模拟了DEL构建和筛选的真实环境，对弹头进行了“压力测试”，包括：库纯化过程、在不同筛选缓冲液（如Tris、Hepes、咪唑、DTT）中的稳定性，以及-20°C干粉储存后的状态。绝大多数弹头表现稳定，仅有4个在含咪唑的缓冲液中不稳定的弹头被淘汰，确保了最终库成员在筛选过程中的可靠性。

　　第四关：聚焦成药性。在通过上述重重关卡后，我们还综合评估了弹头的物理化学性质，并参考了已上市共价药物的结构特征。

　　经过这一系列严苛的筛选，我们从最初的262个弹头中，精挑细选出64个最优弹头，并将其整合到我们的共价DEL中。

　　图4：弹头选择标准。

　　为了深入探究弹头数量对筛选效果的影响，我们匠心独具地构建了三个DEL库套装（图5），分别包含7个（红框）、32个（绿框）和64个（蓝框）共价弹头，为后续的对比研究做好准备。

　　图5：64个用于共价DEL构建的共价弹头结构，三个DEL库套装分别包括7个弹头（红框）、32个弹头（绿框）、64个弹头（蓝框）。

　　技术揭秘：

　　共价DEL筛选，多少“投入”算是恰到好处？

　　在成功构建了高质量的CoDEL库后，另一个关键问题浮出水面：每次筛选，究竟需要投入多少库分子，才能以最优的成本获得最清晰的信号？这不仅关乎筛选的成功率，更直接影响到研发的效率和成本。

　　为了回答这个问题，我们进行了一项精细的研究，使用15个包含32种弹头的库，针对JAK3蛋白，系统性地测试四种不同的分子起始投入量：每个分子5×102拷贝、1×103拷贝、1×104拷贝和1×105拷贝。结果显示，信号强度与投入量直接相关，筛选信号强度与库的输入水平存在明确的关联性。投入的分子数越多，最终获得的富集信号就越强。然而，虽然最高的投入（1×105拷贝）能产生最强的信号，但其带来的库消耗量和测序成本也显著增加，从投入产出比来看并非最优选择。综合分析后，我们确定“每个分子1×104拷贝”的投入量，是产生可靠、置信信号的最佳选择。

　　基于此次及过往的丰富经验，我们建议：对于特定靶点项目，推荐采用“每个分子1×104拷贝”作为共价DEL筛选的起始条件。对于超大型共价DEL库，为了在集体信号强度和测序成本效益间取得平衡，“每个分子1×103拷贝”也是一个值得考虑的选项。而最稳妥的做法是，针对具体的靶点项目，进行一次小规模的预筛选测试，以确定最适合的投入量。

　　图6：（A）不同DEL投入量对信号影响的筛选方案；（B）DEL1630在不同DEL投入量下的三维信号视图；（C）使用32种弹头的15个DEL在不同投入量下的信号强度比较。

　　去伪存真：

　　CoDEL筛选中的“终极考验”——洗脱

　　在共价DEL筛选中，一个至关重要的步骤是最后的变性/洗脱。这一步如同“大浪淘沙”，其目的是利用变性条件破坏氢键、疏水作用等弱相互作用，从而彻底洗去那些“滥竽充数”的非共价结合分子，只留下与靶点蛋白形成了牢固共价键的真正结合者。

　　那么，哪种洗脱方法最为高效？为了回答这个问题，我们使用15个含有32种弹头的库，系统评估了四种常见的变性方法：热变性、尿素、盐酸胍和SDS。

　　结果揭示了不同方法的独特表现。从总回收分子数看，排序为：热变性（S1）>尿素（S2）≈SDS（S4）>盐酸胍（S3）。关键在于，热变性法产生了最低的背景信号，这意味着它最有效地清除了非特异性结合在磁珠上的“噪音”分子。当扣除背景，只看真正与靶点结合的分子信号时，排序变为：热变性（S1）>尿素（S2）≈盐酸胍（S3）>SDS（S4）。SDS虽然能强力洗脱背景分子，但其条件过于剧烈，以至于“误伤”了一部分真实的共价结合物，导致其靶点结合信号反而最弱。

　　综合来看，热变性法在当前实验条件下取得了最佳平衡，既能最大程度地去除非共价结合物，同时也能够高效地回收真实的共价结合苗头化合物，从而将筛选背景降至最低，确保了筛选结果的高度可信。当然，成功应用热变性法有一个关键前提：靶点蛋白与磁珠之间的连接必须足够稳固。由于蛋白是通过其亲和标签（如His标签）固定在磁珠上进行筛选的，必须确保在加热洗脱过程中，这个连接不会先于共价键断裂。只要蛋白-磁珠捕获系统足够牢固，并对加热条件（温度、时长）进行精心优化，热变性无疑是共价DEL筛选的首选洗脱方案。

　　图7：（A）探究不同洗脱方式对筛选结果影响的选择方案；（B）比较采用32种弹头的15个DEL在不同洗脱方式下的回收率；（C）比较采用32种弹头的15个DEL在不同洗脱方式下的信号强度。

　　精益求精：

　　CoDEL筛选的“降噪”艺术——预清除策略

　　CoDEL筛选通常只需一轮，因此实验设计必须精益求精，特别是在控制最终测序数据的“信噪比”和成本方面。为了有效降低背景噪音，我们在正式筛选前引入了一个关键的“预清除”步骤。如结果所示，我们先将DEL库与固定了JAK3 C909S突变体蛋白的磁珠进行孵育。这一步如同“安检”，能够提前拦截并去除非特异性结合磁珠的分子，以及虽然能结合蛋白但只是作用于突变体与野生型共有非功能区域的分子。此外，经过两轮C909S预清除后，筛选输出的总分子数降至最低。这意味着背景噪音得到了最大程度的压制，从而有效降低了测序成本。因此，从输出数据和成本效益综合考量，两轮预清除是最优方案。

　　那么，预清除是否会误删真正的“苗头化合物”呢？最后，在扣除了磁珠结合和突变体蛋白结合的背景后，采用不同预清除方法的S01、S03、S05组都显示了几乎无差别的强富集信号。这表明，真正的靶点特异性共价结合物被完好地保留了下来。相反，S02、S04、S06组的信号则极为微弱，因为它们在数据分析时被扣除了能与突变体结合的分子。这一正一反的结果，强有力地证实了S01、S03和S05中筛选出的化合物都是作用于预设靶点的真实结合物，极大地增强了筛选结果的可靠性。

　　图8：（A）探究预清除步骤对筛选结果影响的选择方案；（B）不同预清除方法之间回收率的比较；（C）DEL1187在不同预清除方法下的信号强度比较。

　　收官之战：

　　一套精心设计的JAK3 CoDEL筛选方案

　　在确立了共价DEL筛选的各项最优条件后，我们为其装配了最终的“行动蓝图”——一套针对JAK3靶点、设计精密的筛选方案，旨在从190亿分子的浩瀚库中，精准锁定所需的苗头化合物。面对如此庞大的库，我们采用了每个分子1×103拷贝的投入量，在保证库分子充分代表性和控制下游测序成本间取得了平衡。我们使用了JAK3的催化结构域，并平行设置了野生型（WT）和突变型（C909S）两种蛋白。

　　为了全方位地鉴定和表征结合分子，我们平行设置了8个筛选组，如同布下了一张“天罗地网”：

　　· S1 & S5：发现“主力军”，直接筛选JAK3 WT，旨在发现所有能结合野生型蛋白的分子，是苗头化合物的主要来源。

　　· S2 & S6：寻找“同类”，在筛选中加入已知的共价抑制剂Ritlecitinib作为竞争剂，旨在发现那些能与该明星化合物竞争结合在同一口袋的分子。

　　· S3 & S7：确认“攻击点位”，使用C909S突变蛋白进行筛选。此组旨在排除那些不结合在目标Cys909位点而结合在其他半胱氨酸或非共价位点的分子，确保后续命中化合物的作用机制明确。

　　· S4 & S8：排除“干扰项”，用于扣除那些非特异性结合在蛋白His-GST标签上的分子，进一步净化信号。

　　为了洞察结合动力学，除了标准的1小时孵育时间（S1-S4），我们还特别设置了4小时的延长孵育时间（S5-S8）。这一巧妙的设计，有助于区分不同共价弹头的反应活性，并观察DEL分子与JAK3蛋白结合的时间依赖性，为后续优化提供宝贵线索。

　　表1：识别特异性结合JAK3蛋白C909位点分子的筛选方案。

　　核心启示：

　　CoDEL技术的两大关键结论

　　经过从库设计、条件优化到最终筛选的完整历程，我们的研究针对共价DEL技术的两大核心问题，得出了具有指导意义的关键结论。

　　结论一：共价DEL，并非“可逆”加“弹头”那么简单。我们首先验证了传统的“先可逆，后共价”策略在DEL筛选中的可行性。对于已发现的共价抑制剂（如B1、E1），若将其分子中的共价弹头移除，其抑制活性完全消失。对照筛选失败：在相同条件下，使用不包含任何共价弹头的对照DEL库（投入量更高）对JAK3进行筛选，结果未产生任何显著的富集信号。这两项证据强有力地表明，成功的共价DEL筛选依赖于可逆识别单元与共价弹头之间的协同作用。这证实了直接使用共价DEL进行筛选的必要性和独特技术优势，因为它能发现那些无法通过简单“嫁接”弹头得到的全新结构。

　　图9：（A）去除弹头后活性显著丧失的代表性化合物；（B）代表性共价化合物库与其对照库的信号比较。

　　结论二：“弹头”不在多，在于精：7个或许刚刚好。我们深入探究了共价弹头的数量对筛选效果的影响（图10）。通过分析三个不同规模的DEL库（分别含7个、32个、64个弹头），我们发现含有7个弹头的CoDEL库表现最佳——这个包含7个经过临床验证弹头的精简库（红框），实现了效率与质量的完美平衡，它不仅成功捕获了所有已验证活性的JAK3抑制剂，同时也保持了极高的筛选信噪比。弹头过多反受其累——将弹头扩充至32个（绿框）时，引入了显著的假阳性信号。例如，化合物B8测序计数很高但无活性；化合物C3看似有中等活性，但在延长孵育后活性丧失，证实其并非共价机制。64个弹头库信号无效——进一步扩大弹头数量至64个（蓝框），并未产生可用的筛选信号。这表明，对于JAK3而言，一个聚焦的、仅含7个优质弹头的DEL库，能通过最大限度地减少非特异性相互作用带来的噪音，实现筛选成功率的最大化。虽然最理想的弹头数量可能因靶点而异，但本研究为共价DEL的理性设计建立了关键框架。它深刻揭示了共价DEL技术的核心优势，并为未来针对不同靶点高效构建共价库提供了宝贵的数据支持和实践指南。

　　图10：分析弹头对筛选结果的影响。

　　深远意义：

　　共价DEL技术解锁新药发现新范式

　　本研究通过对JAK3靶点的成功筛选，充分展示了DNA编码化合物库（DEL）技术在共价药物发现领域的变革性力量——它能够同步探索广阔的化学空间与反应空间，从而高效地发现全新先导化合物。

　　此次研究不仅收获了6个系列强效、高选择性的JAK3共价抑制剂，更使我们对于共价DEL技术本身有了更深层次的理解。

　　第一，确立直接共价筛选的明确优势。共价弹头移除后活性的完全丧失，与非共价对照库筛选的彻底失败，共同终结了关于传统“先可逆，后共价”策略在DEL筛选中的争议。这雄辩地证明了，对于共价药物发现，直接进行共价DEL筛选是更优越、更高效的路径。

　　第二，揭示“靶点导向”的弹头库设计原则。我们的研究证实，对于JAK3（其Cys909残基暴露于溶剂中），一个仅包含7个精选弹头的DEL库便已足够。这为行业提供了关键设计参考：更大并不总是意味着更好，弹头库的规模应取决于靶点本身的结构特性。对于拥有更隐蔽或反应性更低残基的复杂靶点，则可能需要更加多样化的弹头来探索特定的共价结合模式。因此，为特定靶点“量身定制”共价DEL库至关重要。

　　综上所述，我们的发现显著增进了业界对CoDEL筛选的理解，并为一个稳健、高效的共价药物发现框架奠定了坚实基础。这项研究是成都先导在CoDEL领域深度耕耘的缩影，它不仅产出了具体的候选苗头化合物，更输出了宝贵的研发方法论。未来，成都先导将继续秉持创新精神，将这套经过实践检验的CoDEL技术体系应用于更多具有挑战性的靶点，与全球合作伙伴一道，加速推动创新药物的问世。